血漿中的外泌體蛋白既可以當作標志物，也可以進行機理研究？首先，研究人員將慢性淋巴瘤（CLL）患者分為2個亞組：疾病進展期和疾病慢性期。然后利用質(zhì)譜技術(shù)分析了患者血漿外泌體蛋白組，發(fā)現(xiàn)S100-A9蛋白在進展期CLL患者中明顯高表達，可以作為CLL進展期診斷的輔助標志物。進一步，研究人員通過生信分析發(fā)現(xiàn)進展期CLL患者外泌體中的高表達蛋白質(zhì)主要與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，而NF-κB通路正是承接此效應(yīng)的關(guān)鍵通路。通過從進展期CLL患者中分離富含S100-A9蛋白的外泌體加入CLL患者的PBMC細胞中，證實了S100-A9+外泌體能夠明顯促進進展期CLL患者PBMC細胞中IκBα蛋白的磷酸化上調(diào)，進一步活躍NF-κB通路。該研究證通過血漿外泌體蛋白組分析不只找到輔助診斷進展期CLL的標志物，并證實了S100-A9+外泌體可通過形成正向反饋調(diào)控，不斷活躍進展期CLL患者自身PBMC細胞中的NF-κB通路，促進CLL進展的特殊機理。隨著今后的研究發(fā)展，外泌體功能逐步清晰，并擴大臨床應(yīng)用。體液外泌體融合實驗

外泌體mirRNA和蛋白質(zhì)被認為是NSCLC的預(yù)后因子。Dejima等在研究NSCLC患者預(yù)后的生物標志物時發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-4257和miR-21的含量顯著上升。此外，還有研究表明，低水平miR-146a-5p的NSCLC患者較高水平miR-146a-5p的NSCLC患者有更高的復(fù)發(fā)率。Sandfeld-Paulsen等在研究276例NSCLC患者血漿的外泌體時發(fā)現(xiàn)，NY-ESO-1是單獨對低生存率有顯著影響的標志物。Silva等利用TaqMan低密度芯片的方法系統(tǒng)分析了28位NSCLC患者體內(nèi)的365種miRNA，其中l(wèi)et-7f、miR-30e-3p和miR-20b表達均下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，let-7f和miR-30e-3p水平可以區(qū)分早期和晚期NSCLC患者，高水平let-7f和miR-30e-3p與不良預(yù)后密切相關(guān)。成都外泌體miRNA測序外泌體具有異質(zhì)性，即使是同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有比較大功能區(qū)別。

血漿中的外泌體蛋白既可以當作標志物，也可以進行機理研究？首先，研究人員將慢性淋巴瘤（CLL）患者分為2個亞組：疾病進展期和疾病慢性期。然后利用質(zhì)譜技術(shù)分析了患者血漿外泌體蛋白組，發(fā)現(xiàn)S100-A9蛋白在進展期CLL患者中明顯高表達，可以作為CLL進展期診斷的輔助標志物。進一步，研究人員通過生信分析發(fā)現(xiàn)進展期CLL患者外泌體中的高表達蛋白質(zhì)主要與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，而NF-κB通路正是承接此效應(yīng)的關(guān)鍵通路。通過從進展期CLL患者中分離富含S100-A9蛋白的外泌體加入CLL患者的PBMC細胞中，證實了S100-A9+外泌體能夠明顯促進進展期CLL患者PBMC細胞中IκBα蛋白的磷酸化上調(diào)，進一步活躍NF-κB通路。研究證通過血漿外泌體蛋白組分析不只找到輔助診斷進展期CLL的標志物，并證實了S100-A9+外泌體可通過形成正向反饋調(diào)控，不斷活躍進展期CLL患者自身PBMC細胞中的NF-κB通路，促進CLL進展的特殊機理。

外泌體分離的主要挑戰(zhàn)之一是消除納米級污染物，包括干擾外泌體標志物解析的游離核酸和脂蛋白。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù)。盡管如此，它仍難以符合臨床應(yīng)用所需的標準，主要是由于該方法得到的外泌體純度不足，產(chǎn)量較低，完整性欠佳且分離純化操作耗時長。其他方法，例如基于聚乙二醇（PEG）的沉淀，磷脂酰絲氨酸親和捕獲，尺寸排阻色譜法和膜親和捕獲，近年來已經(jīng)出現(xiàn)在特定的應(yīng)用中，但是只適用于特定場景。近來，非對稱流場-流分離方法已被用于從細胞和瘤子培養(yǎng)基中高分辨率地分選EV亞群，但其通量受到繁瑣的樣品制備程序的影響。單一分析耗時的過程也限制了其普遍的應(yīng)用。因此，目前亟需開發(fā)創(chuàng)新技術(shù)以提高外泌體分離純化的效率，純度，產(chǎn)量，速度和耐用性?；诔瑸V的技術(shù)提供了潛在的有前途的替代方法，但它們也有缺點。在切向流過濾中，使進料流平行于多孔膜流動，以避免堵塞。然而，盡管已實現(xiàn)使用切向流過濾從大量條件細胞培養(yǎng)基中濃縮外泌體，但受制于其一次性模塊的成本高，高剪切應(yīng)力，難以處理小體積樣品等因素而難以應(yīng)用于臨床分析。外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。

外泌體可以由體內(nèi)或體外培養(yǎng)的幾乎所有類型的細胞分泌,并廣fan存在于血漿、膽汁、尿液、母乳、唾液、胸腔積液、淋巴、胃酸、支氣管肺泡灌洗液、腦脊液、眼淚、滑膜液、羊水、腹水、鼻分泌物和子宮抽吸物液體等體液中。目前,基于不同的分離原理,研究者建立了五種主要的提取純化技術(shù),分別為基于質(zhì)量密度的超速離心技術(shù)、基于粒徑大小的分離技術(shù)、基于溶解性質(zhì)的聚合物沉淀技術(shù)、基于免疫親和原理的分離技術(shù)和基于流體性質(zhì)的微流控技術(shù)。外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運融合蛋白annexins、RAN、GTPases。研究所提取試劑盒步驟

因外泌體內(nèi)含mRNA、microRNA等核酸和蛋白質(zhì)對相鄰細胞具有交換信息的功能。體液外泌體融合實驗

在Rameshwar等的研究中，采用轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞的方法，使外泌體載有anti-miR-9。在進行間充質(zhì)細胞和多形性成角質(zhì)細胞瘤(GBM)細胞間anti-miR-9傳遞的實驗時，發(fā)現(xiàn)兩種細胞不僅可以通過縫隙連接介導(dǎo)的細胞間通訊(GJIC)也可以通過外泌體傳遞anti-miR-9。且anti-miR-9降低兩種GBM細胞(U87和T98G)對中流藥物替莫唑胺(TMZ)的抵抗能力的功能主要由外泌體傳遞的anti-miR-9實現(xiàn)，而非經(jīng)GJIC傳遞的anti-miR-9，顯示出外泌體在運載miRNA進行基因zhiliao時的潛力。利用外泌體進行GBM的zhiliao不只停留在體外細胞實驗上，也已經(jīng)有相關(guān)的體內(nèi)zhiliao報道。體液外泌體融合實驗

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